流式細(xì)胞儀是一種用于細(xì)胞分析的實驗室儀器，它能夠?qū)蝹€細(xì)胞進(jìn)行快速而精確的定量和質(zhì)量分析。它主要通過將細(xì)胞懸浮液注入到儀器中，利用激光器照射細(xì)胞并檢測經(jīng)過細(xì)胞的光線散射和熒光信號，從而獲取大量有關(guān)細(xì)胞形態(tài)、大小、復(fù)雜度、表面標(biāo)記以及內(nèi)部分子的信息。它可同時測量多個參數(shù)，并具備高通量性能，能夠快速分析數(shù)以萬計的細(xì)胞，并提供詳細(xì)的統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)。它廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的研究和實驗中。
然而，在分析流式細(xì)胞儀得到的熒光結(jié)果時，常常會遇到一些問題，如信號強(qiáng)度弱、背景高、細(xì)胞群分布異常等。本文將介紹常見問題，并提供相應(yīng)的解決方法。
一、信號強(qiáng)度弱
1. 信號補償不正確：檢查流式細(xì)胞儀上的單色陽性對照是否設(shè)置正確，并確保門控和補償設(shè)置正確。
2. 用于檢測的抗體不足：增加抗體的量或濃度。
二、熒光強(qiáng)度高
1. 抗體濃度過高：減少每個樣本中添加的抗體量。
2. 過量抗體被捕獲：洗滌步驟要充分，并在洗滌緩沖液中加入吐溫或Triton，以保持細(xì)胞的透化作用。
3. 封閉不足：在抗體混合液中加入1%-3%的封閉劑，并增加封閉步驟。
三、背景高/陽性細(xì)胞百分比高
1. 增益設(shè)置過高/補償過低：使用陽性對照正確設(shè)置流式細(xì)胞儀，并使用補償減少小顆粒背景信號和降低增益。
2. 抗體過量：降低抗體的濃度，并在洗滌緩沖液中加入去污劑，確保洗去過量的抗體。
四、在應(yīng)該只有一個細(xì)胞群的情況下觀察到兩個或多個細(xì)胞群
1. 表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞群不止一個：檢查樣本中包含的細(xì)胞類型預(yù)期的蛋白表達(dá)水平，并確保細(xì)胞充分分離。
2. 出現(xiàn)細(xì)胞雙峰：細(xì)胞雙峰顯示為第二大細(xì)胞群，其熒光強(qiáng)度大約是單細(xì)胞熒光強(qiáng)度的兩倍。在染色前用移液槍將細(xì)胞輕柔混勻，并在細(xì)胞儀中運行之前再次混勻。
五、側(cè)向散射背景偏高（來自小顆粒）
1. 細(xì)胞裂解：確保樣本中的細(xì)胞沒有裂解和破碎，樣本應(yīng)新鮮并正確制備，避免高速離心或激烈渦旋的操作。
2. 細(xì)菌污染：確保樣本不受細(xì)菌污染，細(xì)菌會自動發(fā)出較弱的熒光，導(dǎo)致高事件率。
六、低事件率
1. 每毫升的細(xì)胞數(shù)過少：將細(xì)胞稀釋至1×105至1×106個細(xì)胞/mL，確保細(xì)胞均勻混合。
2. 細(xì)胞聚集阻塞管道：在染色前輕柔吹打幾次，確保得到同源單細(xì)胞懸液，也可以篩選或過濾細(xì)胞，去除團(tuán)塊。
七、高事件率
1. 細(xì)胞數(shù)量過多：稀釋樣本至1×105至1×106個細(xì)胞/mL。
通過以上問題及解決方法，我們可以更好地分析流式細(xì)胞儀得到的熒光結(jié)果。然而，需要注意的是，不同實驗條件可能會導(dǎo)致不同的問題和解決方法。因此，根據(jù)實際情況，選擇合適的解決方案是很重要的。同時，定期檢查和維護(hù)流式細(xì)胞儀，以確保其正常運行，也是避免問題發(fā)生的重要措施。
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